正确检测和评定乳腺癌的HER2蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要。HER2检测结果不仅涉及患者是否适合针对HER2的靶向治疗，并且对内分泌治疗、化疗方案的选择及预后评估起指导作用。2006年我国《乳腺癌HER2检测指南》的发布对提高乳腺癌HER2检测水平起到了积极作用。2009年我国病理学家再次发布了《乳腺癌HER2检测指南(2009版)》，强调了HER2检测结果的判读标准、检测的技术路线、内部 及外部质量控制等，进一步推进了我国乳腺癌HER2检测的标准化。近年来针对HER2阳性乳腺癌的曲妥珠单抗在临床取得了较好疗效。新药如拉帕替尼、帕妥珠单抗、T—DMl 等也逐渐被用于临床。与此同时，HER2检测中也出现了一 些新的问题。2013年，美国临床肿瘤学会／美国病理医师学院(ASCO／CAP)公布了在2007版ASCO／CAP HER2检测 指南。基础上的更新版本。本指南结合我国实际情况， 在《乳腺癌HER2检测指南(2009版)》的基础上，补充相关领域的新内容和新观点，旨在进一步提高HER2检测的可重复性和准确性，更有效地评估乳腺癌患者的预后，为患者的个体化治疗提供依据。

      一、检测方法
      推荐采用免疫组织化学(IHC)法检测HER2受体蛋白的表达水平，应用原位杂交(in situ hybridization，ISH)法检测 HER2基因扩增水平。ISH包括荧光ISH(fluorescence in situ hybridization，FISH)和亮视野ISH。常用的亮视野ISH方法有显色ISH(chromogenic in situ hybridization，CISH)和银 增强ISH(silver—enhanced in situ hybridization，SISH)。本指南推荐IHC与ISH相结合的检测策略。

      二、检测时机及临床病理联系
      所有乳腺原发性浸润癌都应进行HER2检测。只要能获取肿瘤组织，对复发灶或转移灶也应该进行HER2检测。如HER2检测结果为不确定，则应使用另一种检测方法进行检测，或对该患者的其他样本进行检测。加强临床病理沟通有助于对HER2检测结果的正确诠释和对HER2靶向治疗疗效的客观评价。临床医师和病理医师均需注意HER2检 测结果是否与组织病理学特征相符，如组织学分级为1级的浸润癌通常为HER2阴性，包括浸润性导管癌、经典型浸润 性小叶癌、小管癌、黏液癌、筛状癌、腺样囊性癌等。如检测结果为阳性，则视为检测结果与组织病理学特征不符合，需要核实诊断或重新检测。

      三、HER2检测流程
      乳腺癌标本一般可先经IHC检测。IHC3+为HER2阳性，IHC0和1+为HER2阴性。IHC2+为HER2不确定病例，需进一步应用ISH的方法进行HER2基因扩增状态检测，也可以选取不同的组织块重新检测或送条件更好的实验室进行检测。

      四、组织标本的制备
      1．标本类型：(1)手术切除标本；(2)粗针穿刺活检标本；(3)麦默通活检标本。
      2．标本固定：所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定 (1 h内)。固定时应将标本每隔5～10 mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6—72 h为宜。
      3．固定液类型：4％中性(磷酸缓冲)甲醛固定液。
      4．组织切片：(1)未染色的切片置于室温不宜超过 6周，以防抗原丢失。(2)用于IHC染色者切片厚度以3～ 5斗m为宜，ISH法以4—5斗m为宜。(3)完成检测的切片， IHC和亮视野ISH可按常规长期保存，FISH结果应立即照 相存档并于一20℃保存，建议至少保存3个月备查。(4)各 种检测方法均应有HE染色切片作为对照。

      五、染色要求与结果判读
      建议使用我国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒，对自行组配的检测系统则必须经过严格的内、外部质量 控制，建立完善的实验室标准操作程序(SOP)，并与权威机构批准的检测试剂盒进行比对，以保证检测结果的可靠性。
      (一)IHC
      1．观察程序：应先在低倍镜下观察整张切片，判断染色 是否满意及是否存在HER2表达的异质性。正常乳腺上皮 不应出现强的细胞膜着色。只评定浸润癌的着色情况，导管 原位癌的着色不能作为评定对象。观察细胞膜着色的浸润癌细胞的比例及着色强度，若出现细胞质或细胞核着色提示 IHC染色效果不理想或组织处理不佳，建议调整染色条件或 更换组织后再行染色。判读时应避开组织边缘及组织处理 不佳(如明显挤压)的癌组织。
      2．结果判读及注意事项：结果判读标准(按每张切片 计；图1，2)：0：无染色或≤10％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1+：>10％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：有两种情况，第一种为>10％的浸润癌细胞呈现不完整和／或弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10％的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3+：>10％的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。 对于2+的病例，应该用ISH做进一步检测，也可以选取不同的组织块重新检测 或送条件更好的中心实验室进行检测。 当出现下列情况时HER2状态为无法判 读(indeterminate)，包括标本处理不当、严重的组织挤压或边缘效应、检测失败等。应在报告中注明HER2状态无法判读的可能原因，并建议再次获取样本进行HER2检测。在乳腺浸润性微乳头状癌和部分有分泌现象的乳腺癌中，有时浸润癌细胞的细胞膜已呈很深的棕褐色， 但却并未呈闭环状完整着色，存在一定程度的不连续性和间断胜，此时至少应视为HER2 2+，并需要行ISH检测进一步 明确HER2状态。建议在HER2 IHC检测报告中包括如 下内容：患者信息(包括姓名、性别、年龄、门诊／住院号)、送 检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、 标本部位和类型、抗体信息(克隆号／生产商)、检测方法、是 否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(O、1+、2+、3+)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)。
      3．质量控制：包括抗体的选择、抗原修复方法、染色及其他相关实验室技术，均应严格按SOP进行。IHC自动染色系统更易达到标准化，但也应进行严格的比对试验和程序优化，且需要对机器进行定期维护。IHC染色须设立对照， 以不同染色程度的组织芯片作为对照为最佳。被检测切片中癌旁正常乳腺上皮细胞是很好的阴性内对照。利用计算机图像分析有利于判断的准确性和可重复性，但必须经过病理医师确认其结果，且设备使用前必须进行校验。        (二)FISH
      FISH技术通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的 DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下观察并分析细胞核内杂 交于DNA靶序列的探针信号，以获得细胞核内染色体(或染 色体片段)上基因状态的信息。目前进行HER2基因状态检 测的探针多为同时含有HER2基因和该基因所在的第17号 染色体着丝粒(CEPl7)序列的双探针，也可采用仅含有 HER2基因的单探针。
      1．观察程序：应在低倍镜下观察整张FISH切片，初步 判断检测质量以及是否存在HER2扩增的异质性。要求至 少找到2个浸润癌区域，计数至少20个浸润癌细胞。也可 以参照IHC切片先确定可能存在扩增的浸润癌区域，然后 于100倍物镜下通过特异通道滤光片观察HER2和CEPl7 信号，并进行信号计数和比值计算。
      2.结果判读及注意事项：应选择细胞核大小一致、核的 边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核无重 叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中 的双色信号。在观察信号时，应根据情况随时调节显微镜的 焦距，准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏。判 读标准(图3～5)：双探针ISH：(1)当HER2／CEPl7比值≥ 2．0时，为HER2阳性；HER2／CEPl7比值<2．0，但平均 HER2拷贝数／细胞≥6．0时也为HER2阳性。扩增细胞应 均质、连续，且占浸润癌的10％以上。需要注意的是对于 HER2／CEPl7比值≥2．0，但平均HER2拷贝数／细胞<4．0 的病例是否应该视为ISH阳性目前尚存一定争议。建议对 这部分病例在报告中加以备注，提示目前的认识争议，建议 临床医师参考IHC检测结果并与患者进行必要的沟通。(2)HER2／CEPl7比值<2．0且平均HER2拷贝数／细胞< 4．0时为HER2阴性。(3)HER2／CEPl7比值<2．0且平均 HER2拷贝数／细胞<6．0，但i>4．0时为HER2 ISH结果不确 定。单探针1SH：肿瘤细胞平均HEt／2拷贝数／细胞<4．0为 无扩增；肿瘤细胞平均HER2拷贝数／细胞≥6．0为扩增。 扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。平均HER 拷贝数／细胞在4～6之间为不确定。若众多HER2信号连 接成簇时可不计数，直接视为基因扩增。对于ISH结果不确 定的病例．需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位 分析者重新计数。如仍为临界值，则应行IHC检测(若FISH 前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。建议在 HER2 FISH检测报告中包括如下内容：患者信息(包括姓 名、性别、年龄、门诊／住院号)、送检医师姓名、送检日期、标 本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、探针信 息、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是 否适合评估、判读结果(包括评估的细胞数量、平均HER2拷 贝数／细胞、平均CEPl7拷贝数／细胞、平均HER2拷贝数／平 均CEPl7拷贝数的比值)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、 无法判读)。
      3．质量控制：(1)内对照：使用上述同时含有HER2基 因和CEPl7序列的混合探针时，组织中≥75％的细胞核显 示出双色信号时视为杂交成功，并且双色信号互为对照，癌 与非癌细胞互为对照。出现下列情况时应视为FISH检测失 败，包括：①对照样本未出现预期结果；②浸润癌病灶太小， 难以观察到两个浸润癌区域并计数；③可计数信号的细胞< 75％；④>10％的荧光信号位于细胞核外；⑤细胞核结构难 以分辨；⑥有强的自发荧光。(2)外对照：应选择已知FISH 阳性和阴性的标本片(或采用厂家提供的对照片)作为外对 照，且杂交染色结果与预期相符。(3)如有可能，建议设置 低扩增对照。
      4．关于第17号染色体数目：FISH双探针检测中加入 CEPl7探针的目的是为了在检测HER2基因的同时检测第17号染色体数目，从而将第17号染色体的非整倍体和单纯 的HER2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。但近 年来的研究显示整条第17号染色体的多体罕见，CEPl7的 多体并不能代表整条第17号染色体多体。部分乳腺癌 中第17号染色体存在HER2基因和着丝粒的共同扩增。 越来越多的学者认为，与HER2／CEPl7比值相比，HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要。因此在 HER2 FISH检测结果中除报告HER2／CEPl7比值外，还应 分别报告HER2拷贝数和CEPl7的数值。
      5．关于HER2基因的异质性：浸润性乳腺癌中HER2表 达或扩增可存在异质性。虽然HER2基因异质性的临床意 义目前仍不明确，但它可导致IHC与ISH检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。 在ISH计数之前，应观察整张切片或使用IHC确定可能存在 HER2扩增的区域。需要强调的是，即使存在异质性，但只要扩增细胞连续、均质，且占浸润癌lO％以上，就应明确报告为ISH阳性。可补充报告不同细胞群(>10％)的计数值 (包括计数的细胞总数、HER2拷贝数、CEPl7数值、HER2／ CEPl7比值)，并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。       (三)SISH
      SISH中目前运用最广泛的是双色银染ISH(dual—colorin—situ hybridization，DISH)。在此检测中通过二硝基苯 (DNP)标记的探针检测HER2，并利用银染ISH DNP染色液进行显色。用地高辛标记探针检测CEPl7，采用地高辛红染 显色液。DISH可在光镜下观察结果，其中HER2在肿瘤细胞的细胞核中表现为黑色信号，CEPl7为红色信号。也可采用仅针对HER7．基因的单探针SISH。
      1，观察程序：结合HE染色，选定含有浸润性乳腺癌的靶区进行观察。选定区域内的大部分细胞需同时显示黑色和红色信号，且这些信号没有被非特异性背景染色覆盖。计数至少20个浸润癌细胞。在4倍物镜下扫描整张切片，观 察是否存在HER2表达的异质性以及标本质量。然后于高倍镜(40倍或60倍物镜)下观察结果并进行信号计数和比值计算。
      2．结果判读(图4～6)：(1)应选择细胞核大小一致、核的边界完整、细胞核无重叠、红色和黑色两种信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞 核中的双色信号。(2)当存在HER2 信号簇时，可根据单个拷贝大小估计拷贝数。判读标准：参见FISH，如果最 终结果为不确定，则需要再计算20个 细胞核中的信号或由另外一位分析者 重新计数。如结果仍为不确定，则应 行IHC检测(若SISH前未行)，也可以 选取不同的组织块重新检测。报告格式可参照FISH检测。
      3．质量控制：(1)内对照：可以乳 腺组织中的正常细胞(如成纤维细胞、 血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上 皮细胞)的HER2信号和CEPl7信号 作为内对照。出现下列情况时应视为 检测失败，包括：①对照未出现预期结 果；②难以观察到至少两个浸润癌区 域并计数；③缺乏红色染色或黑色染 色；④斑点伪影干扰计数；⑤严重消化 过度或细胞核中空泡干扰计数；⑥非 特异性背景染色强，干扰计数。(2)外 对照：建议在每次染色过程中都加入 阳性和阴性对照，以用于确认试剂质 量和仪器功能。
      (四)CISH
      在CISH检测中多使用地高辛标 记的探针，在石蜡切片上进行ISH反 应，再用鼠抗地高辛一抗体和辣根过氧 化物酶一抗鼠抗体进行免疫结合，二氨基联苯胺显色后，在普 通显微镜亮视野下观察HER2基因信号。也有关于双探针 CISH的报道。CISH检测可以同时显示基因状态与组织形 态学，且检测切片可长期保存。
      1．观察程序：结合HE染色，选定含有浸润性乳腺癌的 靶区进行观察，区域内的大部分细胞需有棕色信号，且这些 信号没有被非特异性背景染色覆盖。计数至少20个浸润癌 细胞。在低倍镜下观察整张切片，确定标本质量及是否存在 HER2扩增的异质性。然后于高倍镜(40倍或60倍物镜)下 进行信号计数。
      2．结果判读(图4，5，7)：(1)应选择细胞核大小一致、 核的边界完整、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数
至少20个浸润癌细胞核中的HER2信号。(2)判读标准：参 照FISH。如果最终肿瘤细胞平均HER2拷贝数／细胞<4．0 为无扩增；肿瘤细胞平均HER2拷贝数／细胞≥6．0为扩增。 平均HER拷贝数／细胞在4～6之间为不确定。如果最终结 果为不确定，则需要再计算20个细胞核中的信号或由另外 一位分析者重新计数。如结果仍为不确定，则应行IHC检 测(若CISH前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。 报告格式可参照FISH检测。
     3．质量控制：(1)内对照：可以乳腺组织中的正常细胞 (如成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细 胞)的HER2信号作为内对照。出现下列情况时应视为检测 失败，包括：①对照未出现预期结果；②难以观察到至少两个 浸润癌区域并计数；③缺乏细胞核内的棕色信号；④严重消 化过度或细胞核中空泡干扰计数；⑤非特异性背景染色强， 干扰计数。(2)外对照：建议在每次染色过程中都加入阳性 和阴性对照(可采用厂家提供的质控对照片)，以用于确认 试剂质量和仪器功能。

      六、实验室要求
      HER2蛋白和基因扩增的检测均应在内、外部质量控制 良好的病理实验室进行，必须严格按照指南要求的程序操 作，以保证结果可靠。不具备HER2检测条件的单位应按照 指南规定妥善地准备好标本，提供给有质量保证的病理实验 室进行检测。实验室内、外部质量控制和SOP的主要要求 如下：
      1．准备开展乳腺癌HER2检测的实验室有责任确保其 检测结果的可靠性和准确性。无论哪一种检测方法的开展 均需要通过严格的比对验证，也可通过参加有关外部质量控 制活动(建议每年进行1～2次)来实现。
      2．内部质量控制工作包括定期对相同组织的不同批次 染色结果进行重复性分析，每次染色阳性、阴性对照的设置， 如有可能还应设置低表达／低扩增对照。检测相关的仪器和 设备需定期维护、校验。
      3．应建立完善的SOP，并做好检测情况的记录和存档 工作。
      4．任何操作程序和试剂的变化均应重新进行严格的比 对验证。
      5．从事乳腺癌HER2检测的实验技术人员和病理医师 应进行必要的培训和资格考核。

      总之，准确的HER2检测是患者得到正确治疗的基石。HER2检测的影响因素贯穿在检测前、检测中及检测后的多个环节，规范化的操作程序和标准化的结果判读能提高 HER2检测的准确性和可重复性。在HER2检测过程中一 定要重视多学科合作的重要性，加强临床与病理的交流沟通 有助于对HEB2检测结果的正确诠释及对治疗疗效的客观 评价。

      免责声明：本指南只代表本编写组观点，供各临床病理 实验室结合各单位实际情况参照使用。本编写组不对因使 用本指南而引起的直接或问接损失承担任何责任。